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產品詳情
操作說明
注意事項
產品簡介
目前最常用的蛋白濃度定量檢測方法有兩種，即Bradford法和BCA法。Bradford法原理是基于考馬斯亮藍G250能與蛋白質快速結合。考馬斯亮藍G250在游離狀態下呈紅色，最大光吸收在488 nm，其與蛋白質結合后在595 nm處有最大吸收值，并且光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用于蛋白質的定量檢測。本方法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學物質的影響，樣品中β-巰基乙醇的濃度可高達1 mM，二硫蘇糖醇的濃度可高達5 mM；但受略高濃度的去垢劑影響，需確保SDS含量低于0.01%，Triton X-100含量低于0.05%，Tween-20，Tween-60，Tween-80等含量低于0.015%。含去垢劑的樣品推薦使用本公司生產的BCA蛋白濃度測定試劑盒。
本試劑盒操作簡便快捷，靈敏度高，檢測速度極快，可檢測蛋白濃度范圍為25-1000μg/mL。
儲存與運輸
整套試劑可常溫運輸；蛋白標準品（BSA）4℃保存，有效期12個月。配制成蛋白標準溶液后需-20℃保存，并在6個月內使用。
操作步驟
1. 配制蛋白標準貯備液：取1 mL蛋白標準配制液加入到蛋白標準品（BSA）管中，將25 mg蛋白標準品完全溶解，即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標準貯備液。配制成的蛋白標準溶液可-20℃長期保存。
2. 配制蛋白標準工作液：取適量25 mg/mL蛋白標準貯備液，用PBS或生理鹽水稀釋50倍，得到終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標準工作液。注意稀釋時按照10倍梯度方法稀釋，確保稀釋準確。
3. 繪制標準曲線（酶標儀法）：將蛋白標準工作液分別按0，1，2，4，8，12，16，20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理鹽水依次加20，19，18，16，12，8，4，0 μL將上述梯度工作液補足到20 μL。得到蛋白濃度依次為0，25，50，100，200，300，400，500 μg/mL的梯度曲線。
4. 準備待測樣品：將待測的蛋白樣品進行適當稀釋（可通過預實驗檢測，使樣品蛋白濃度在標準曲線范圍內，確保檢測結果可信），按照每個樣品20 μL的量加到96孔板中。待測樣品與蛋白標準品用相同溶液稀釋。
5. 檢測：向以上每孔加入200 μL考馬斯亮藍G250溶液充分混勻（可將96孔板放在振蕩器上振蕩30 s），室溫放置3-5 min后，以標準曲線0號做參比，在595 nm波長下比色測定，記錄各孔吸光度值。
6. 計算：以標準曲線中梯度蛋白含量（μg/mL）為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪出標準曲線。根據所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可查得相應孔中待測樣品的蛋白濃度（μg/mL），再乘以樣品稀釋倍數即為待測樣品實際蛋白濃度。
另：如用分光光度計測定，則在第3步中將梯度標準品反應體積改為1 mL。向7支潔凈的玻璃試管或比色管中分別加入0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL蛋白標準工作液（濃度0.5 mg/mL），然后各管中依次分別加入PBS或生理鹽水1.0，0.95，0.9，0.8，0.6，0.4，0.2，0 mL，將梯度工作液補足至1 mL，每管充分混勻，即得到蛋白濃度依次為0，25，50，100，200，300，400，500 μg/mL的梯度曲線。
待測蛋白樣品做適當稀釋后，加入到新的玻璃試管或比色管中，樣品量為1 mL。
向上述標準曲線梯度管及樣品管中各加入考馬斯亮藍G250溶液3 mL，充分混勻，室溫靜置3-5 min后用分光光度計進行比色檢測。
檢測時分光光度計波長設置595 nm，以標準曲線0號管為參比調零，檢測標準曲線及待測樣品。按照步驟6中的方法繪制標準曲線及計算待測樣品中的蛋白濃度。
注意事項
1. 考馬斯亮藍G250溶液使用前需恢復至室溫，并顛倒混勻，以免影響檢測的靈敏度。
2. 在進行蛋白標準貯備液的配制時，需確保溶解充分。稀釋配制蛋白標準工作液時建議10倍梯度稀釋，不要一次稀釋50倍，以免產生較大誤差。
3. 操作時請穿實驗服，并佩戴一次性手套。
產品僅供科研用途，不用于臨床診斷！
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